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    泛素小史

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    泛素小史
    譯者注:此文是譯作,原文作者是日本科學家田中啟二。原文載于2004年土羊社出版的“ユビキチンがわかる“。轉載時請注明原文作者,譯者名jsj97,譯文原文載于。
    作者簡介:田中啟二,1976年從德島大學醫學院研究科大學院博士課程中途退學,經過德島大學酶研究所助手,酶科學研究中心助教授,從96年起東京都醫學院研究機構東京都臨床醫學綜合研究所分子腫瘤學研究部門部長,2002年至今任同研究所副所長。
    譯者前言:當初引起我翻譯這篇文章的沖動是因為他寫得很好,使我有一種想好故事大家分享的想法。但凡是說起容易,做起來難,各種專業名詞和本人并不高的日語水平,使得這片并不長的文章的翻譯時間拖了又拖。盡管我盡了最大努力,我仍然無法確定內容的權威性,大家最好僅僅當做一個故事,而對細節的正確與否請放過。
    1 泛素發現的前夜
    現在回想泛素的發現,不能不提到兩個先驅性的研究。泛素的發現最早要回溯到半個世紀前,1953年,Simpson 利用當時普及的放射性同位素進行代謝實驗,發表了“生物細胞中的蛋白質分解中需要代謝能量即需要ATP的加水分解”的論文。但是,這個劃時代的研究,在以后的很長一段時間里,被人忽視了。在當時熱力學的世界觀中,加水分解反應是產能反應,與需要能量的合成反應不同,這個過程是不需要能量的。另一個先驅性的研究是Goldberg等的論文(1977),他們報道在試管內再現Simpson所觀察到的現象。這篇論文喚醒了在圖書館底沉睡的Simpson的發現。Goldberg等報道網織紅細胞的提取液中加入ATP顯著促進了蛋白質的分解,也就是伴隨著蛋白分解有能量的消耗。這個發現中,選擇網織紅細胞是獨具慧眼的。Goldberg等注意到網織紅細胞向紅細胞最終分化時候,不再需要的核,細胞器,溶酶體等細胞內的蛋白質在細胞內快速分解,也就是在蛋白質合成活躍的網織紅細胞中,其分解活性也非常高?梢赃@么說,這個選擇決定了一切。實際上,如果不是在網織紅細胞的提取液中加入ATP,離體進行Simpson 的實驗觀察,泛素的發現可能還要等上好多年。ATP依賴性的蛋白分解在在體情況的發現,暗示了其生化學的可能機制。
    上面的研究和其他關于蛋白質分解的不可思議現象開始吸引人們的目光。1960年代前期,發現了充滿了加水分解酶細胞器--溶酶體,因此其被認為蛋白分解的主要器官。但是溶酶體的非選擇性破壞方式難以說明在細胞器中壽命和表達水平千差萬別的蛋白質個體間的矛盾。不過在當時,這只是少數意見并逐漸銷聲匿跡了。但在70年代,隨著溶酶體機能抑制劑的開發,經過這些試劑處理過的細胞仍然有恒定的蛋白質分解難以抑制,表明了存在與溶酶體不同的蛋白分解系統,基于這些觀察,當時稱之為“非溶酶體的蛋白質分解系統”。沒過多久,這個“非溶酶體的蛋白質分解系統”與前面所提到的“ATP依賴性的蛋白分解系統”便合二為一了。
    為了保持溶酶體和細胞器內的酸性pH值,需要代謝能量,但這些能量是來自膜型的ATP泵(ATPase)的作用,與Goldberg等所觀察到的細胞質的能量消耗的機制是完全不同的。實際上,像大腸桿菌這樣的不含細胞器的原核生物的蛋白質分解也是需要代謝能量的,由此明確了ATP依賴性蛋白水解酶系和溶酶體系統是相互獨立存在的。接著,在大腸桿菌內發現了ATP依賴性的蛋白水解酶的Lon酶(共有絲氨酸蛋白水解酶和ATP泵酶結構的多功能酶)。Goldberg等人從Lon酶的經驗出發,堅信真核細胞中也存在ATP依賴性的蛋白水解酶,而在當時,發現并建立了網織紅細胞系統的Goldberg團隊對探明ATP依賴性機制也擁有絕對的信心,但在這場大戲中確有意想不到的劇情出現,將他們所預想奪取到的“探明在真核細胞中ATP依賴性的蛋白質分解機制”的光榮全部奪走,打破Goldberg團隊美夢的就是巨星Hershko和Varshavsky.
    2 從APF-1的認定到泛素的發現
    Hershko在60年代后期,在以倡導“誘導酶”而聞名的Tomkin研究室中報告了類固醇激素誘導的酪氨酸轉移酶的半衰期顯著縮短,其分解代謝需要能量。1971年,他回到了祖國以色列,繼續進行蛋白質分解的研究,1977年受到使用網織紅細胞的Goldberg等人的“ATP依賴性的蛋白分解系統”等相關論文的啟發,同當時是研究生的Ciechanover一同進行探明其機制的工作。他們采用化學方法分離,純化網織紅細胞提取液中的階段性的相關因子。很快的,在1978年得到了通過DEAE-cellulose方法的“階段1”和采用吸附高濃度鹽析的“階段2”。 幸運的是,這些操作只是通常的為了將紅血球內大量的血紅蛋白除去的生化學解析方法。階段1和階段2單獨幾乎難以見到ATP的促進效應,但當二者混合時,可以觀察到ATP的促進效應。這個結果,顯示了ATP依賴性的蛋白質分解路徑是復合的,并以簡報的形式刊載在BBRC(1978)上。他們將這篇小論文作為自己最值得自豪的業績,即便在現在的講演中,也常常提及。
    此后不久,在階段1中成功提純ATP-dependent proteolysis factor(APF-1)。APF-1是熱穩定性很好的小分子蛋白。當時推想,APF-1是階段2內存在的尚未認定的蛋白水解酶的活化因子,采用I125標記的APF-1以檢測其相互作用的分子。但結果出現了令人驚奇的現象,125I -APF-1是以高分子梯狀出現的,而且明確了這個修飾反應在ATP加水分解反應中是必要的,F在這個現象作為聚泛素化的現象是很自然的事情,但在當時不難想象他們驚訝的程度。與原來的預想不同,1980年,APF-1被認為是底物蛋白質與所消耗的能量共價結合的產物。
    現在有必要介紹一下泛素的研究歷史,最初在1975年,Goldstein把它當作胸腺激素的一種發現的,但不久就明確了其不過是標本中混入的物質,也就是說,泛素是一種“被錯誤發現的分子”。但是正是在這個研究,創造了“泛素”這個名字得以流傳史冊。Goldstein等人,為了強調這個物質在所有的組織細胞中普遍存在,即其普遍性(ubiquity),稱其為泛素(ubiquitin)。在1977年,Goldknopf和Busch在細胞周期的研究中認定了在染色體的組蛋白2A中與其異肽鏈結合的分子為泛素。這篇“泛素與蛋白質共價結合”文章為明確泛素修飾反應機制帶來了光明。接著,在1980年,Hershko與其共同研究者一道證明了APF-1和泛素是同一物質。再次驗證了泛素的功能。
    3 Hershko的泛素假說
    很快Hershko和Ciechanover提出了泛素在蛋白質分解中所起的基本作用的假說:泛素通過E1(活化酶),E2(結合酶),E3(連接酶)的多級反應,與目標蛋白共價結合,多數泛素分子枝狀連接,形成聚泛素鏈,而聚泛素鏈成為蛋白水解酶攻擊的標記,被捕捉到的目標蛋白被迅速的分解。這個“泛素假說”后來得到廣泛的稱贊。這個假說的要點在于代謝能量是泛素活化所必須的,從概念上講,ATP的消耗在了蛋白分解的信號形成上了。這個假說,對于Goldberg等人所預想的ATP依賴性的蛋白水解酶的概念完全不同,這種對能量依賴性蛋白質分解機制的解釋不亞于晴天驚雷。有必要說明的是,這一系列的研究的是由生物化學方法所取得的,而和當時蓬勃發展的分子生物學技術并無關聯。
    在Hershko和Ciechanover提出泛素假說的最初5年間竟然沒有競爭對手的出現,這在和平年代里是極為罕見的。當然,這也與當時大家都難以相信這種“當時難以想象的現象”有關,對于他們的假說的可信度人們總是投去懷疑的目光。這也是獨創性到達了超世的境界,高處不勝寒的典型例子。但這種獨創性過高的同時也常常帶了些不幸。由于其超出常識,Nature,Science等世界超一流的雜志也不相信他們的發現,在很長一段時間內拒絕刊登。
    4 Varshavsky的遺傳學的研究
    對于泛素系統離體作用的證明中,貢獻最大的是Varshavsky和他的共同研究者,其門生很多,(Finley, Jentsch, Hochstrasser 等),現在仍然作為這個世界的帶頭人活躍著。Varshavsky在1977年,從原蘇聯莫斯科染色體研究所移居到了美國波士頓的MIT(麻省理工)。當時他主要在進行染色體的研究,由于這個關系,他注意到了Goldknopf和Busch關于泛素修飾的報告,并且圍繞泛素化的組蛋白H2A的染色體相關機能進行了研究。以這個為契機,1980年左右 ,Varshavsky開始使用出芽酵母的逆遺傳學技術對泛素系統進行研究。接著,將Hershko等在生化學所認定的E1,E2,E3等酶群所對應的酵母基因一個一個的分離出來。這些研究將明確了泛素鏈作為細胞體內實際分解信號的機能,將“泛素假說”的假說在文字上去掉了。同時他們以一連串的遺傳學的研究取得了關于泛素系統相關的許多前瞻性的研究 成果。在當時,這一連串在Nature, Science, Cell雜志上發表的論文,在5年間席卷蛋白質分解的世界?紤]到他們的研究對后來人的影響,他們的工作是值得大加贊揚的。
    5 蛋白質水解酶體的發現
    作為精彩的范例,“泛素假說”從能量依賴性的蛋白質分解機制的觀點來看,仍然有一個重大的缺陷,這就是泛素修飾只是ATP消耗的一個裝置而已。1983年,筆者和Goldberg通過證明泛素修飾后的蛋白質分解仍然需要ATP的加水分解,因而主張“在蛋白質分解的過程中ATP依賴性的2段學說”。也就是說,雖然已經證明泛素以能量依賴性的信號附加機制,作為蛋白水解酶的攻擊標識這個概念是正確的,但是實際上泛素修飾后的蛋白質分解仍然需要能量。這個假說的要點在于作為第二個ATP的消耗的分子機制,與原核生物一樣,真核生物也存在著同樣的ATP依賴性蛋白水解酶。這意味著在泛素登場前Goldberg的預測,一半是正確的。這個推斷帶來了稱為蛋白水解酶體的ATP 依賴性的蛋白水解酶的發現。蛋白水解酶體最早出現在科學雜志上是1988年,但搞明白它的分子結構是在10多年以后;ㄙM如此長的時間的理由在于這個酶體是一個分子量達到250萬,總的亞基數達100個的生命科學史上最大最復雜的分子集合體。
    蛋白質水解酶體是和已知的蛋白水解酶從概念上完全不同的新奇酶體,它的發現路程,可以稱得上是一部電視連續劇。筆者作為這個酶體發現及其之后的研究進展的當事人之一,很遺憾將不能在這里講述“蛋白質水解酶發現故事”,不過,有興趣的讀者可以去看看我的個人主頁(http://www.rinshoken.or.jp)。(譯者注:日文的)
    6 泛素生物學研究的點火點
    本文講述的不過是泛素發現的故事,對于其后泛素研究的進展,是難以用一言兩語概括的。有關泛素依賴性蛋白質分解系統的生物學飛躍發展,而由這種突破所帶來的是發現與其相關的疾病和患者也是愈來愈多。本文只想記述有關其生物學發現前驅性研究的一個例子。1980年,在進行細胞周期研究的一個日本團隊(東京大學名譽教授山田正篤等)分離了可以誘導染色體異常凝固的溫度感受性的變異細胞ts85,并報告了在將這個細胞進行非限制溫度下培養時發現修飾組蛋白H2A的泛素消失。當時,對組蛋白泛素化研究的Varshavsky,注意到了這篇論文,獲得了ts85細胞,證實了ts85細胞存在泛素活化酶E1的變異,并使用這種細胞證明了泛素參與短壽命蛋白質分解的。這篇1984年的報告是最初關于泛素系統在細胞內生理機能的里程碑式的論文。同時對ts85細胞研究也成為了研究泛素在控制細胞周期中重要性的重要手段。
    1983年,Hunt發現了在細胞分裂期間周期性變動的蛋白質CyclinB, 接著在1991年,由Hershko團隊和Kirschner各自獨立發表了CyclinB的周期性分解和泛素依賴性蛋白質分解系統相關的論文,細胞周期的研究從此掀開了新的一頁。接著,Hershko通過生化學的方法分離出CyclinB泛素化的E3連接酶,命名為cyclosome。這個多少有些夸大其詞的名稱來自能夠檢測到泛素化的CyclinB與其有20S的巨大分別。但是cyclosome最初也被投以懷疑的眼光。“所謂E3酶會不會是膜或是其他什么的尚未認定的分子的結合的產物呢?”等等疑問不絕于耳。而在1996年,出現了將這些疑問完全打消的事件。世界上幾個不同的研究團隊探明了cyclosome也稱為APC(anaphase-promoting complex)的分子結構。其結果探明了APC是由10幾個亞體構成的巨大分子復合體,F在成這個酶為APC/C。接著,京都大學的柳田充弘教授和Kim Nasmyth通過分離正在分離的染色體中異常誘導的酵母基因組,明確了APC/C構成亞基和其多數情況下的靶分子。這是證明在細胞周期控制中,泛素依賴性的蛋白分解系統的重要性的決定性事件。這個結果揭開了ts85細胞在非允許溫度下染色體異常凝固的謎團,也使得對細胞周期M期,也就是染色體分配的機制的研究到達了分子水平。在以后對細胞周期的研究中,泛素系統的重要性也變得愈來愈重要。特別是SCF和Mdm2等新泛素連接酶的發現,對它們的研究,證實了在細胞周期的順利進行中,check point的調控中泛素依賴性的蛋白質分解的中心作用。這些結果,確立了細胞周期是由蛋白質的磷酸化反應與泛素控制的蛋白水解控制的概念,這被稱為近年來癌研究的最大成果。
    7其后對泛素研究的
    距離1984年Finley, Ciechanover, Varshavsky 使用ts85細胞,在Cell雜志上發表了“泛素與細胞內蛋白質分解相關”的文章已經20年了。2004年,Cell雜志為了紀念這個發現,刊登了當事人的回憶文章。按照與這個發現有關的Pickart的回憶,1984年與泛素相關的文章不足100篇,2003年已經超過了1000篇。這也從側面反映了泛素研究的飛速發展。而且在生命科學領域的頂級雜志Nature, Science, Cell中,每期都登載有“泛素話題”,現在關于泛素的研究仍然處于未見衰減的快速發展中。泛素—蛋白水解酶體作為決定體內眾多生體反應能夠快速,順序,一過性,單向進行的合理手段,在細胞周期,凋亡,代謝調節,免疫應答,信號傳遞,轉錄控制,質量管理,應激應答,DNA修復等生命科學中眾多領域起到了中心的作用,已經成為了難以動搖的事實。
    對泛素的研究也取得了意想不到成果。舉一個例子,最初提到的組蛋白的泛素化的研究中,也清楚了泛素也具有除了蛋白質分解外的機能,例如,現在已經探明,在胞飲,小泡運輸等的選擇,病毒的出芽等細胞內的物質流通系統,或是DNA修復,翻譯控制,信號傳遞中,泛素是起到了信號分子的作用。再舉一個例子,細胞存在著許多類似泛素分子(即泛素樣蛋白質),它們獨立形成了巨大的“蛋白質的由蛋白質進行的對蛋白質翻譯后的修飾系統”。它們對通過基因信息的增幅基因的進行控制,能夠發揮基因模體上沒有的功能。更令人驚訝的是,泛素相關聯的基因群,占基因總數的2-3%。泛素,真的是難以說是一種普通的蛋白質。
    泛素的發現中做出貢獻的Hershko, Ciechanover, Varshavsky在2000年被授予Albert Lasker Award。在2001年,以“Regulation of cellular function by the ubiquitin-proteasome system”為題目的第34回諾貝爾會議在斯德哥爾摩召開。Hershko, Goldberg, Varshavsky等所發起的FASEB Summer Conference “Ubiquitin and Protein Degradation” 對泛素的研究進展有重大貢獻。第一屆在1989年,以后隔年召開,2004年為第8屆。第一屆的時候,參加者主要是上面3位偉人與其弟子。不過是泛素研究者的小型聚會,F在,這種情況已經改變,參加者半數以上是筆者不認識的年輕研究者。加之從2003年開始,由CSH symposium組織的“泛素之家”,今后,這兩個會議將交替每年舉行。而且關于蛋白水解酶將于2005年在Clermont-Ferrand(法國)舉行第6屆Proteasome Workshop。這些定期的國際會議以外,Keystone Symposium和EMBO workshop還對泛素話題頻繁舉行不定期的會議。從這些情況來看,現在泛素的正處在蓬勃發展的時期。但令人遺憾的是,高潮之后的世界將是怎樣的,仍然是未知的。果真能夠給生命的理解帶來福音么,或是仍然徘徊在謎亂的深淵。對于筆者個人來說,雖然并不指望過長的壽命,但想在泛素的研究看見完結的曙光時告別這個世界。

    諾貝爾化學獎的獲獎及其影響
    2000年Hershko, Ciechanover, Varshavsky獲得Albert Lasker 基礎醫學獎。這個獎被稱為其獲得者的一半將獲得諾貝爾獎,從這個時候起,泛素開始被視為諾貝爾獎的候選者。在第二年也就是2001年,以“Regulation of cellular function by the ubiquitin-proteasome system”為題目的第34回諾貝爾學會在斯德哥爾摩的Karolinska研究所召開,這次會議除了Hershko, Ciechanover, Varshavsky,Goldberg等人,還召集了細胞周期,免疫,神經等關于這方面研究的專家。接著,就如大家所知道的那樣,2004年,Hershko, Ciechanover, Rose 等3人獲得了諾貝爾化學獎。
    對于這個諾貝爾獎的獲得,無論是當事人還是相關領域的研究者都是既歡迎又驚訝的。因為竟然“沒有Varshavsky而是Rose”,“不是醫學生理學獎而是化學獎”。
    Rose是使用ATP的酶反應學的權威,在初期和Hershko, Ciechanover共同進行研究,對泛素修飾反應的機制的探明有重大的功績。其后,其在人才的培育上也有非凡的成就。在最初使用生化學手段主張泛素假說,這3名學者有極大的功績。
    我個人的看法,Varshavsky未能獲得諾貝爾獎的確是非常令人遺憾的。如果沒有Varshavsky的杰出工作,現在對泛素的研究也難以擴展到現在這個地步。而且,Varshavsky在Nature, Cell, Science等雜志上刊登關于泛素系統的論文有數十篇之多。與此相對的是,此次獲獎的3人幾乎為0。大概這個所代表的意義是,現代的基因工學,分子生物學等現代技術的快速發展,這種進步的本身就應該帶來人體基因解析的大幅進步,而這回這3個人使用的以前生化學和酶學的基礎性的所謂低技術而有了這種新概念的發現,有特別重大的意義。 因此,授予諾貝爾獎是對這種獨創發現的最初發現的表彰吧。諾貝爾委員會正是標榜自己來表彰這種“最初的發現”的,F代高度發展的生命科學量產了大量論文,而這回諾貝爾化學獎的授予也可以說是為這種真正帶有獨創意味的發現所做得特別警示吧。
    另外還有一件事,使這回得獎后在nature刊登的軼事。Hershko在諾貝爾醫學和生理學獎頒布的第二天,他原來計劃準備和孫女一起去游泳,結果從由堂兄打來的電話得到了被授予諾貝爾化學獎的消息(諾貝爾委員會是使用電報通知受獎者,而在這之前廣播播發了短信,聽到了這個消息的堂兄通知了本人)。也就是,對獲得化學獎是極其意外的。是的,近年來,泛素的研究在醫學,病態生理學等領域日漸擴大,很多人認為更應該授予醫學生理學獎,實際上卻是化學獎。這個化學獎,有必要把目光放在蛋白質作為配體的獨特調節機制的發現及其生物學意義這一焦點問題,進行正確地認識。Hershko的智慧,Ciechanover卓越的技術和行動力,Rose深刻的酶學素養,這3個個性和才能毫不相同的科學家共同努力的結果,建立了泛素作為蛋白質分解信號的假說。
    泛素-蛋白酶體途徑研究進展
    摘要 泛素-蛋白酶體途徑是一種高效蛋白降解途徑,主要負責真核細胞內蛋白的選擇性降解。此途徑參與體內許多重要的生理功能,包括細胞周期的調控、抗原遞呈、轉錄調控、凋亡、信號轉導等等,許多疾病的發生都是由于這一途徑的異常引起的,本綜述主要對其組成、作用機制及其功能在當前的研究進展以及未來的研究方向作一介紹。
    關鍵詞 泛素;蛋白酶體;蛋白降解
    泛素-蛋白酶體途徑是上世紀80年代早期由Aaron Ciechanover等人發現的蛋白降解途徑。這個途徑主要作用是對細胞內的蛋白質進行降解,它能夠選擇性的降解蛋白質,使細胞內各種蛋白質的降解受到精確的調控。而通過這個途徑安全有效地進行眾多重要蛋白質的降解,對于維持細胞的許多重要生理功能(如細胞周期的調控、抗原遞呈、信號轉導等)有著極其重要的作用。目前發現的許多遺傳性和獲得性疾。ㄈ缒[瘤、囊性纖維化)的發生都與此途徑功能失調有關。本綜述主要對這一途徑的組成、作用機制及其功能在當前的研究進展及方向作一介紹。
    1.  泛素-蛋白酶體途徑的組成成分及作用機制
    1.1 組成成分
    泛素-蛋白酶體途徑由泛素、泛素活化酶、泛素偶聯酶、泛素-蛋白連接酶、26S蛋白酶體、泛素再循環酶組成。
    ⑴泛素(ubiquitin) :是由76個氨基酸殘基組成的多肽,分子量約8.5kD, 高度保守,存在于所有真核細胞內。因其存在豐富而廣泛故被稱之為泛素或泛在素。它主要的作用是以多聚泛素鏈的形式與要降解的底物蛋白結合,從而標記底物蛋白,以便于下一步降解蛋白。Muller[4]等人發現了類泛素蛋白SUMO,它們也標記底物蛋白但并不促使其降解,而似乎是為了使其更加穩定或其它功能,其具體機制正在研究之中。
    ⑵泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme,E1):是由兩個亞基組成的二聚體,兩個亞基分子量各約為105kD。目前僅發現一種有功能的E1,其功能主要是在ATP的參與下激活泛素,以利于進行下一步反應。是催化泛素與蛋白結合所需要的第一個酶。
    ⑶泛素偶聯酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2s):是催化泛素與底物蛋白結合所需要的第二個酶,E2s的功能是與E1傳遞過來的泛素相結合,發揮其載體功能,以利于進行下一步反應。目前已有30余種E2s被分離出來,多數E2s為小分子量蛋白質,且均含有一個保守的核心結構域,約14~16kD, 其內含有與泛素結合所需的半胱氨酸殘基。
    ⑷泛素-蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligating enzymes,E3s):是催化泛素與底物蛋白結合所需要的第三個酶,它的主要功能是負責選擇性識別蛋白底物,催化蛋白泛素化。目前發現的E3s有幾十個,由于新的E3s不斷被發現,可能E3s的數量比我們目前所知的要多得多。E3s結構相差較大,但大多數E3s是含有環指結構的蛋白質。8個半胱氨酸和組氨酸與兩個鋅離子相互作用構成了這個環指結構。到目前為止已發現了5個不同的E3s家族:第一個是N-末端規則酶E3α,這類酶通常與N-末端具有某些堿性氨基酸殘基(如精氨酸、賴氨酸)或與N-末端具有大量的疏水氨基酸殘基(如苯丙氨酸、亮氨酸)的蛋白質結合;第二個是HECT(homologous to E6-AP C-terminus)結構域家族,E6-AP可以間接和腫瘤抑制因子p53結合,導致p53蛋白的泛素化。人類基因組至少可以編碼20個不同的HECT結構域蛋白。 還有3種不同類型的高分子量多亞基復合體,分別叫做APC(anaphase promoting complex),PULC (phosphoprotein-ubiquitin ligase complexes)和CBC(cullin elongin B/C)連接酶。它們與細胞周期調節因子和轉錄調節因子的降解有關。蛋白底物只有本身具有識別信號才能被E3識別,目前發現了四種可能的識別信號。
    ⑸E4 在酵母菌中發現一種能與較短的泛素鏈結合促進長泛素鏈形成的蛋白,稱之為E4。
    ⑹26S蛋白酶體(26S proteasome):是一個非常巨大的復合體,至少有50個亞基組成,約2000kD,它占細胞內總蛋白質的1%左右。26S蛋白酶體是由一個20S核心蛋白酶體和兩個19S調節復合體結合而成的。20S蛋白酶體是由兩個α環和兩個β環疊加在一起形成筒狀結構,兩個β環在內側,其內含有催化位點,兩個α環在外側,位于β環兩側。每個環各由7個亞基組成,真核生物的α環和β環各由7個不同的亞基組成,20S蛋白酶體的基本結構可表示為α1~7β1~7β1~7α1~7。20S蛋白酶體含有多種蛋白酶活性:①類糜蛋白酶活性:水解疏水性氨基酸后面的肽鍵;②類胰蛋白酶活性:水解堿性氨基酸后面的肽鍵;③谷氨酰水解酶活性:水解酸性氨基酸后面的肽鍵;④支鏈氨基酸肽酶活性;水解支鏈氨基酸后面的肽鍵;⑤中性氨基酸切割活性。研究表明各活性部位之間可以互相調節。多肽在20S蛋白酶體內降解的限速步驟是其被類糜蛋白酶位點切割,這步產生的多肽碎片進一步被其它的活性位點切割,如谷氨酰水解酶。兩個19S調節復合體位于20S蛋白酶體的兩端,19S復合體至少有18個不同的亞單位。19S復合體的功能是識別泛素化的底物蛋白、展開底物蛋白、打開α環外面的一個室口、把底物運到20S蛋白酶體內,整個過程需要消耗能量,而19S復合體含有6個不同的ATP酶亞單位。
    ⑺泛素再循環酶(ubiquitin recycling enzymes):包括泛素C-未端水解酶(ubiquitin c-terminal hydrolases UCHs)、同工肽酶(isopeptidases)、去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)。這類酶的功能是①通過水解多聚泛素鏈和促進泛素前體轉化成泛素維持游離泛素的濃度;②使錯誤標記的底物蛋白去泛素化;③使多聚泛素鏈從26S蛋白酶體上分離下來,以免影響對其它蛋白的識別;④調節泛素化蛋白的降解速度,在一些情況下甚至通過移除或縮短多聚泛素鏈來阻止泛素化蛋白的降解。
    1.2 作用機制
    泛素-蛋白酶體途徑對蛋白質的降解可分成兩個連續的步驟:①多個泛素分子與底物蛋白結合,從而標記底物蛋白;②標記了的底物蛋白被26S蛋白酶體降解,釋放并重新利用泛素。而第一步泛素與底物蛋白的結合過程需要3個級聯反應來完成。首先,泛素的C-末端甘氨酸殘基在一個ATP的參與下與泛素激活酶(E1)的半胱氨酸殘基間形成高能硫酯鍵;然后,E1把激活的泛素傳遞給泛素偶聯酶(E2s),泛素與一個E2s活化的半胱氨酸殘基仍以高能硫酯鍵結合;最后,在一個泛素-蛋白連接酶(E3s)的催化下,泛素的C-末端與蛋白底物的賴氨酸殘基以一個酰胺異構肽腱連接,從而完成3步反應。通過上述反應得到的泛素化的蛋白底物中泛素不是單個分子,而至少要有4個泛素分子,通常是后1個泛素分子結合到前1個泛素分子的第48位賴氨酸殘基上,這樣形成的聚合物與蛋白底物連接成復合物,目前在酵母菌中還發現第4種酶,稱作E4,它可以有效的催化長的多聚泛素鏈的形成。第二步底物蛋白的降解,首先是26S蛋白酶體的19S調節復合體識別、結合、展平泛素化的底物蛋白,然后由26S蛋白酶體的催化核心20S復合體最終將蛋白水解成含有3~22個氨基酸殘基的多肽,而多聚泛素鏈在泛素再循環酶的作用下分解成單個泛素分子后釋放出來并被重新利用,從而形成泛素-蛋白酶體途徑的循環。
    2. 與泛素-蛋白酶體途徑有關的生理功能
      泛素-蛋白酶體途徑對細胞蛋白的降解在機體的許多生理功能中都起了很重要的作用,如細胞周期的調控、抗原遞呈、免疫應答和炎癥反應、轉錄的調控、細胞對應激和細胞外效應劑的應答、細胞表面受體和離子通道的調控、DNA的修復、生理節奏的調控、發育和分化、凋亡等等,目前還不斷有新的作用被發現。
    2.1細胞周期的調控
    細胞周期受細胞周期調節蛋白依賴的激酶(Cdks)活性的波動所控制,而這類激酶的活性又受到一些正向調節亞單位、細胞周期調節蛋白的合成與降解及負向調節因子、Cdk抑制劑濃度的波動所控制。目前發現的G1細胞周期蛋白、有絲分裂細胞周期蛋白、Cdk抑制劑p27Kip1及阻止同源染色體分離的蛋白Cut2的降解都與此途徑有關。
    2.2 抗原提呈
    抗原提呈細胞中內源性抗原被蛋白酶體攝取并降解成多肽,該多肽與內質網中合成的MHC-Ⅰ類分子結合,所形成的多肽-MHC-Ⅰ類分子復合物被高爾基體轉運至細胞表面,供CD8+T細胞的TCR識別,并使之激活。
    2.3 轉錄的調控
    轉錄因子如E2F-1,fos,myc,NF-κB都受這個途徑調節。轉錄因子NF-κB主要調控多種炎癥和免疫基因表達,它在胞漿內與其抑制蛋白IκB結合成三聚體呈非活性狀態,當受刺激劑刺激后IκB首先被IκB磷酸化激酶磷酸化,然后被泛素-蛋白酶體途徑降解,從而使NF-κB活化進入核內與相應的DNA位點結合,調節多基因的轉錄。
    2.4 凋亡
    最近研究表明泛素-蛋白酶體途徑在凋亡的調控中起著重要的作用,一些與凋亡有關的調節分子(如Bcl-2、Jun N末端激酶、熱休克蛋白、Myc53)是通過蛋白酶體降解的。在一些實驗中此途徑是起促進凋亡的作用,而另一些實驗中卻起到相反的作用,目前對其在凋亡中的具體作用正在研究之中[14]。
    3. 泛素-蛋白酶體途徑與臨床
    由于泛素系統牽涉到機體許多生理功能,那么由于這個系統的功能失常即功能過強或功能喪失就可能引起許多的病理損害。
    3.1 骨骼肌高代謝
    在嚴重創傷、膿毒癥、惡性腫瘤等多種病理條件下,骨骼肌蛋白質會表現為高分解代謝,長期的高分解代謝對機體十分不利,可以引起肌肉的萎縮和消耗,延遲病人康復,甚至危及病人的生命。而近年的研究表明泛素-蛋白酶體途徑在骨骼肌高代謝的發生中起著最主要的作用。E3α家族和E2s中的E214k的mRNA水平在此情況下的是上調的,說明此二者都與骨骼肌高代謝關系密切,因為我們還不完全清楚其它E2s和E3s的mRNA在此情況下的表達水平及作用,目前還不能判斷二者在骨骼肌代謝中的地位。
    3.2 腫瘤
    在人乳頭狀瘤病毒引起的宮頸癌中,癌蛋白E6可以使腫瘤抑制因子p53通過此途徑快速降解,引起癌細胞內p53含量很低,E6主要起促進連接酶與底物蛋白結合的作用。在前列腺、乳腺、結直腸惡性腫瘤中細胞周期蛋白信賴的激酶抑制劑p27Kip1也處于較低的水平,而p27的迅速降解是由于它的同源E3,Skp2水平的增加。β-鏈蛋白在結直腸上皮分化中具有重要作用,此蛋白也經泛素系統代謝,如大量沉積則導致靶基因持續激活,導致惡性變。
    3.3  遺傳性疾病
    囊性纖維化(CF)是一種常見的多系統紊亂的遺傳病,囊性纖維化跨膜轉導調節因子(CFTR)是一種氯離子通道,由于其編碼基因突變導致CFTR僅能小部分運達細胞膜,其余在內質網中被泛素-蛋白酶體途徑降解而引起疾病[15]。另外還有較少見的遺傳性疾病如Angelman綜合征主要由于染色體片斷缺失而造成E6-AP連接酶異常所致,遺傳性高血壓Liddle綜合征是由于對氨氯吡咪敏感的上皮鈉通道(EnaC)β、γ亞基富含脯氨酸(PY)區域缺失所致,EnaC是通過連接酶與PY區域結合被泛素系統降解的,PY缺失導致EnaC穩定性增高,引起水鈉潴留導致高血壓。
    4. 研究展望
    泛素-蛋白酶體途徑是我們所知的最精細的蛋白降解途徑,對這個途徑分子機制的深入研究將有助于我們對機體各種與之有關的生理功能和疾病的認識。由于目前已經發現了一些疾病中的關鍵蛋白的代謝與泛素-蛋白酶體途徑有關,這導致了新的治療方法的出現即通過調控此途徑對疾病進行治療。目前有些蛋白酶體抑制劑用于癌癥治療,并取得了一定的成效,但由于針對于蛋白酶體的抑制劑的特異性較差,在起治療作用的同時也打亂了機體正常的生理功能,引起較大的副作用,而E3s與蛋白底物的識別與結合是較特異的,阻斷特定的E3s對其蛋白的識別或結合就可以限制其底物蛋白的降解從而起到治療作用,因此通過這種方式實現治療作用的藥物也將有可能出現。

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